Na de gebeurtenissen uit de vorige film wordt de schurk Bowser in piepklein formaat vastgehouden door Mario en zijn broer Luigi. Vanuit zijn gevangenis zingt en smacht hij echter nog steeds naar prinses Peach en houdt hij zijn woede maar moeilijk onder controle. Bovendien is Bowser Jr., zijn maniakale zoon, op oorlogspad. Hij wil zijn vader terughalen en moet het hierbij opnemen tegen de loodgietersbroers. Intussen wordt verderop ook het goede leven van prinses Rosalina bedreigd.
